電洗脫法基本原理
將電泳分離后含目的DNA片段的瓊脂糖切割下來, 裝于透析袋中,繼續在高電壓下電泳,這時目的DNA會從凝膠中電泳出進入透析袋中, 由于DNA分子量大,不能透過透析袋,從而保留于透析袋中。取出透析袋中含DNA的溶液, 進一步用酚、氯仿抽提純化。
電洗脫法實驗方法
(一)透析袋的處理:
1.切取適當長度適析袋。
2.在2%NaHCO3 1mM EDTA溶液中煮沸10分鐘。
3.棄去煮沸液,加無菌水內外反復洗凈透析袋。
(二)電洗脫
1.在長波紫外燈下(300-360nm )將含目標DNA片段的凝膠條帶切下裝入透析袋中。
2.向透析袋內加入2ml電泳緩沖液,使之浸沒凝膠,并排空汽泡。
3.將透析袋水平放入電泳槽(長度方向與電泳平行), 加入適量緩沖液將透析袋浸沒(約6-7mm)。
4.接通電源,150伏電洗,在紫外燈下觀察待DNA全部移出凝膠。
5.改變電場方向繼續通電1分鐘。
6.從透析袋中吸出緩沖液于1-5ml Eppendorf管中。
7.加入1.5倍體積正丁醇,混勻抽提去EB。
8.在臺式離心機上高速2分鐘。
9.吸去上層,正丁醇溶液。
10.重復7,8,9二次。
11.自下層言DNA的溶液中加入等體積酚氯仿(2個)抽提2次。
12.上清轉入另一Eppendorf管中加入1/10倍體積3M NaAc 2倍體積預冷無水乙醇,于20℃過夜。
13.12000g,4℃下離心10分鐘,得DNA沉淀。
14.棄上清,加入70%乙醇洗滌2次后棄干乙醇。
15.加入50μl TE溶解DNA。
16.取10μl DNA溶液加入2μl Loading buffer于0.8%瓊脂糖上, 40伏電泳,3小時。
17.在紫外透射儀上觀察結果。
18.測定DNA溶液OD260,OD280值。
結果與分析
1.計算DNA回收效率,判斷DNA純度。
2.記錄電泳結果
從瓊脂糖凝膠(Agaros gel)中回收DNA片段實驗步驟
1. 配制TAE電泳緩沖液(10′儲存液),10′加樣緩沖液,1.5ml離心管裝入鋁制飯盒(滅菌)、移液器吸頭裝入相應的吸頭盒(滅菌)。
2. 操作步驟
1) 用1′TAE配制1%瓊脂糖凝膠。DNA用合適的酶切。
2) 在膠上選定兩個加樣孔,分別加入少量(10μl)和大量(50μl )DNA酶切產物,電泳。
3) 電泳結束后用刀片切下含有少量DNA酶切產物的泳道(一般選擇位于凝膠的邊緣),在紫外燈下找到目的DNA 帶,用刀片切在帶的下上下邊緣各切一個小口作為標記。注意:含有大量DNA酶切產物的凝膠既不用加熒光染料,也不用紫外燈照射!
4) 將做好標記的凝膠條與未染色的凝膠原位對齊,根據小膠條上的標記估計未染色的大膠上DNA酶切產物的位置,用刀片切下大膠中DNA產物所在的凝膠(盡量不要多余的凝膠),轉移至一個稱量過的干凈的1.5ml微量離心管中。再稱量后計算出膠的重量。
5) 按照DNA快速純化/回收試劑盒操作說明,純化回收目的片段。