紫外交聯儀UCL-3500在RecA突變篩選中的應用
RecA突變體篩選:即讓缺失recA基因的菌株在紫外交聯儀(jiaolianyi)下面照射,沒有缺失的會通過自己修復而存活,缺失的則死亡。
RecA是大腸桿菌中recA基因座的產物,具有雙重功能,能激活蛋白酶并能改變單鏈DNA分子。蛋白酶-激活活性控制SOS 反應;核酸酶活性涉及重組修復途徑。
RecA recA基因產物具有三種生物化學活性:重組活性,單鏈DNA結合活性和ATP酶活性。
RecA蛋白是一種形如纖維,每次通過初形成單體進行伸長和收縮活動的蛋白,在修復受損DNA的過程中發揮重要作用。
是recA基因的產物,分子量約38 000D,為含4個亞基的四聚體。即使DNA分子有斷裂或“空隙”,兩個DNA分子也不一定重組。必須有推動重組反應的酶存在,重組才能進行。在這些酶中主要的是RecA蛋白,它能促使兩個同源DNA分子的堿基配對,形成雜種分子。
反之,兩條完整的同源雙鏈螺旋DNA,即使和RecA蛋白一起混合,也不會發生重組反應。RecA蛋白能特異地識別單鏈DNA,并能將之與同源雙螺旋中的互補順序“退火”,同時將另一條鏈排擠出去,形成所謂D環(D-LOOP)。
RecA蛋白是一種多功能蛋白質,它參與大腸桿菌的同源重組途徑,有單體和多聚體兩種形式。多聚體由單體在單鏈DNA上從5′→3′方向組裝而成。
RecA的主要功能包括:
1.促進2個DNA分子之間鏈的交換;
2.作為共蛋白酶促進LexA 阻遏蛋白的自我水解
RecA蛋白在同源重組的具體作用分為3個階段:
1.RecA的個DNA結合位點(初級位點)與單鏈DNA結合,包被DNA,形成蛋白質-DNA絲狀復合物;
2.RecA的第二個DNA結合位點(次級位點)與1個雙鏈DNA分子結合,形成三鏈DNA中間體,隨后單鏈DNA侵入雙鏈DNA,尋找同源序列;
3.RecA催化鏈交換,由被RecA包被的單鏈DNA從5′→3′方向取代雙鏈DNA分子之中的同源舊鏈,形成異源雙鏈,并發生分叉遷移。
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