變性RNA在膜上的轉移和固定

變性RNA在膜上的轉移和固定

實驗方法原理：
多數情況下，為檢測特定的靶 mRNA，需先將 RNA 通過瓊脂糖電泳分離后，再從膠上轉移到二維支持物上，（通常用尼龍膜)，再與持異的標記探針雜交。正如在 Nonhem 雜交中討論的情況，實驗者可采用多種試劑和膜用于 RNA 的轉移以達到 RNA 和膜緊密結合的效果。我們認為，zui佳的 Nonhern 印跡可通過在中性或堿性條件下將 RNA 從膠上轉移到尼龍膜上。 

實驗材料：RNA 樣品
試劑、試劑盒：乙酸銨 亞甲藍溶液 浸潤液 SSC 轉移緩沖液
儀器、耗材：印跡濾紙、紫外交聯儀、玻璃皿、尼龍膜、有機玻璃或玻璃板、裁紙刀片、厚印跡濾紙、可見光盒、重物、黃色濾光片
 

實驗步驟
一、材料
1. 緩沖液及溶液
含 0.5 μg/ml 溴化乙錠的 0.1 mol/L 乙酸銨
亞甲藍溶液（0.02% 亞甲藍（Sigma，89% 純度）溶于 0.3 mol/L 乙酸鈉（pH 5.5) ）
浸潤液
含 1% SDS (m/V) 的 0.2XSSC
20X SSC
轉移緩沖液

2. 核酸和核糖體
RNA 樣品，瓊脂糖電泳分離

3. 專用設備
印跡濾紙（Schleicher 和 Schuell GB002 或 Sigma P 9039)
交聯設備（如：Stratalinker, Stratagene; GS Gene Linker, Bio-Rad)或微波爐或真空爐
烤干的玻璃皿
帶正電荷或不帶電荷的尼龍膜
轉移過程中用于支持膠的有機玻璃或玻璃板
裁紙刀片
厚印跡濾紙（Whatman 3 MM/L, Schleicher 和 Schuell GB004, 或 Sigma Quick-Daaaraw)
可見光盒
400 g 的重物
照相用黃色濾光片

二、方法
轉移膠的制備
1. （可選）將膠浸入相應的浸泡液中，部分水解經瓊脂糖分離的 RNA 樣品的操作如下。將電泳后的膠經 NaOH 部分水解可提高 RNA 轉移至帶正電荷或不帶電荷的尼龍膜的轉移效率，該處理方法尤其適于瓊脂糖濃度>1%、凝膠厚度>0.5 cm 或待分析的 RNA>2.5kb 的情祝。
(1) 若轉移至不帶電荷的尼龍膜
① 用 DEPC 處理的水淋洗膠
② 將膠浸入 5 倍膠體積的 0.05 mol/L NaOH 中 20 min
③ 將膠轉入 10 倍體積的 20x SSC 中 40 min
④ 直接進入步驟 2，迅速將部分水解的 RNA 通過毛細管轉移到不帶電荷的尼龍膜

(2) 若轉移至帶電荷的尼龍膜
① 用 DEPC 處理的水淋洗膠
② 將膠浸入 5 倍體積的 0.01 mol/L NaOH-3 mol/L NaCl 中 20 min
③ 直接進入步驟 2，迅速將部分水解的 RNA 通過毛細管轉移到帶正電荷的尼龍膜
2. 將凝膠轉移至一個玻璃干烤皿內，用鋒利的刀片修去凝膠的無用部分以保證轉移過程中膠與膜對齊，在凝膠的左上角切取一角以作為下列操作過程中凝膠方位的標記。
3. 用長和寬均大于凝膠的一塊 Plexiglas 或玻璃板作為平臺，將其放入大干烤皿內，上面放一張濾紙。
4. 于干烤皿內倒入相應的轉移緩沖液（帶正電荷的膜用 0.01 moI/L NaOH-3 mol/L NaCl，不帶電荷的膜用 20X SSC) 直至液面略低于平臺表面，當平臺上方的濾紙完全濕透后，用玻棒或移液管趕走的氣泡。

轉移膜的準備
5. 用新的解剖刀或切紙刀裁一張長寬均大于膠 1 mm 的尼龍膜。
6. 將尼龍膜漂浮在去離子水表面直至濾膜從下往上全部濕透，然后將膜浸入 10X SSC 中至少 5 min，用干凈的解剖刀片切去濾膜一角，使其與凝膠的切角相對應。
轉移系統的安裝和 RNA 的轉移
7. 將膠倒轉后置于平臺上濾紙的中央，確保厚濾紙和膠之間沒有氣泡滯留。
8. 用 Saran 保鮮膜或 Parafilm 膜圍繞凝膠周邊，而不是覆蓋凝膠。
9. 用轉移緩沖液浸濕膠（見第 4 步），在凝膠上方放置濕潤的尼龍膜，并使兩者的切角相重疊，濾膜的一條邊緣應剛好超過凝膠上部加樣孔一線的邊緣。
10. 用相應的轉移緩沖液浸濕兩張與膠大小一致的濾紙，放于濕的尼龍膜上，用玻棒趕走的氣泡。
11. 剪一疊 5~8 cm 厚，略小于濾紙的紙巾，放于濾紙上，于紙巾上放一塊玻璃板，然后壓上 400 g 重的重物。
12. 上行流路的 RNA 轉移在中性轉移緩沖液中的轉移時間不超過 4 h, 在堿性轉移緩沖液中不超過 1 h。
13. 拆除毛細管轉移系統，用圓珠筆在膜上標出凝膠加樣孔的位置，將膜轉移至含 300 ml 6X SSC 的玻璃平皿中，然后將平皿放置搖床，室溫 23℃ 輕搖 5 min。
14. 從 6X SSC 溶液中取出凝膠，將多余的液體瀝干后，將膜的 RNA 面向上放置于干的濾紙上數分鐘。

RNA 的染色以及 RNA 在膜上的固定
染色和固定的步驟根據轉移類型、膜的類型以及固定方法不同而有所不同。由于在堿性緩沖液中 RNA 與帶正電的尼龍膜共價結合，故在染色前勿需將 RNA 固定在膜上，而在中性緩沖液中轉移至不帶電荷的尼龍膜上的 RNA，經過染色后，可通過真空干烤 或在微波爐加熱而固定在膜上。若 RNA 通過紫外照射下交聯至膜上，則 RNA 的染色應在固定之后。
轉移至尼龍膜的 RNA 可通過與亞甲藍染色得以鑒定（Herrin and Schmidt 1988), 這一簡單方法可用于 RNA 濃度監測、轉移效率的估計、主要 RNA (通常是 rRNA) 在膜上位置的估計。如果 RNA 是通過紫外交聯固定，則轉至步驟 16。

15. 膜的染色。
(1) 將濕膜轉移至含亞甲藍溶液的玻璃器皿中染色，染色時間視能鑒定 rRNA 而定 ( 3~5 min)。
(2) 在可見光下用黃色濾光片對染色的膜照像。
(3) 照像后，將膜放入 0.2X SSC 和 1%（m/V）SDS 中室溫脫色 15 min。

16. RNA 固定在不帶電荷的尼龍膜上。
(1) 干燥固定
① 待膜在空氣中晾干后，將干燥的膜夾在兩張濾紙間，80℃ 真空爐干烤 2 h。
② 或將濕膜置于干的濾紙上，微波爐里（750~900 W) 以zui大功率加熱 2~3 min。
(2) 紫外照射交聯固定
① 將濕潤的未染色的尼龍膜置于一張干的濾紙上，在波長 254 nm 處按照 1.5 J/cm2 的劑量照射 1 min 45s。
② 紫外照射后，參照步驟 15 用亞甲藍染色。