如何選擇合適熒光蛋白？

自 1992 年綠色熒光蛋白被用于標記基因，各種顏色的熒光蛋白被開發出，目前有上百種的熒光蛋白。在我們的實驗中，經常會用到熒光蛋白，但是如何選擇合適熒光蛋白，得到完美的實驗結果？相信這個問題一直困擾著大家，鑒于此，小編從不同的角度去考慮如何選擇熒光蛋白，希望可以給大家在選擇熒光蛋白方面提供一些幫助。
單體性質將熒光蛋白與目標蛋白進行融合表達，直接地追蹤目標蛋白或是定位目標蛋白，這就要求熒光蛋白是單體，不能影響目標蛋白的功能和定位。因此，我們將熒光蛋白的單體性質放在位。

目前體外檢測熒光蛋白單體性質的方法有分子篩、沉降平衡，可以通過熒光蛋白分子篩的峰圖是否狹窄，單一粗略的判斷其是否為單體，沉降平衡能夠更加準確的確認其聚合性質。我們使用熒光蛋白幾乎都是在細胞內或組織內，因此我們更加關心在生理條件下，熒光蛋白的聚合性質。

科學家巧妙地將熒光蛋白與細胞色素 P450 進行融合表達，讓熒光蛋白定位在內質網的胞質面，熒光蛋白的聚合性質會使鄰近的熒光蛋白聚合在一起，形成聚集體，在激光共聚焦顯微鏡下能夠看到細胞核的周圍有很大的點狀結構。小編已經用此種方法檢測了多個熒光蛋白。

綠色熒光蛋白(GreenFluorescent Protein，簡稱GFP）是在美國西北海岸所盛產的一種名為Aequorea victoria的水母中發現的一種可以發出綠色熒光的蛋白質。GFPzui早是在1962年由日本科學家下村修發現，是由238氨基酸組成的單體蛋白質，蛋白分子量約為27kD。GFP的晶體結構顯示，蛋白質中央是一個圓柱形水桶樣結構，長420nm，寬240nm，由11個圍繞中心α螺旋的反平行β折疊組成，桶的頂部由3個短的垂直片段覆蓋，底部由一個短的垂直片段覆蓋，對熒光活性很重要的生色團則位于桶的大空腔內。實驗表明GFP熒光產生的前提是桶狀結構完整性，去除N端6個氨基酸或C端9個氨基酸，GFP均會失去熒光。原因是GFP生色團的形成效率較低，而且形成過程受外界環境影響較大。

發光原理：
GFP的第65至67位的三個氨基酸（絲氨酸-酪氨酸-甘氨酸）殘基，可自發地形成一種熒光發色團。當蛋白質鏈折疊時，這段被深埋在蛋白質內部的氨基酸片段，得以“親密接觸”，導致經環化形成咪唑酮，并發生脫水反應。在分子氧存在的條件下，發色團可進一步發生氧化脫氫，zui終成熟，形成可發射熒光的形式。具體過程為：在 O2存在下，GFP分子內第67位甘氨酸的酰胺對第65位絲氨酸的羧基進行親核攻擊，形成第5位碳原子咪唑基；第66位酪氨酸的α2β鍵脫氫反應之后，導致芳香團與咪唑基結合，并zui終自發催化形成對羥基苯甲酸咪唑環酮生色。

GFP需要在氧化狀態下產生熒光，強還原劑能使GFP轉變為非熒光形式，但一旦重新暴露在空氣或氧氣中，GFP熒光便立即得到恢復。一般來說弱還原劑并不會影響GFP熒光，中度氧化劑如生物材料的固定，脫水劑戊二酸或甲醛等對GFP熒光影響也不大。

發光特性：
GFP吸收的光譜zui大峰值為395nm（紫外），并有一個峰值為470nm的副吸收峰（藍光）；發射光譜zui大峰值為509nm（綠光），并帶有峰值為540nm的側峰（Shouder）。雖然450～490nm只是GFP的副吸收峰，但由于該激發光對細胞的傷害更小，因此通常多使用該波段光源（多為488nm）。此外，GFP的光譜特性與熒光素異硫氰酸鹽（FITC）很相似，兩者通常共有一套濾光片。GFP熒光極其穩定，在激發光照射下，GFP抗光漂白（Photobleaching）能力比熒光素強，特別是在450～490nm藍光波長下更穩定。類似的，GFP融合蛋白的熒光靈敏度遠比熒光素標記的熒光抗體高，抗光漂白能力強，因此更適用于定量測定與分析。由于GFP熒光的產生不需要任何外源反應底物，因此GFP作為一種廣泛應用的活體報告蛋白，其作用是任何其它酶類報告蛋白無法比擬的。但因為GFP不是酶，熒光信號沒有酶學放大效果，因此GFP靈敏度可能低于某些酶類報告蛋白，比如螢火蟲熒光素酶等。

變體：
在GFP發現的半個世紀中，陸續衍生了多個變體，其中zui的要屬其紅移變體——增強型綠色熒光蛋白（enhanced GFP，EGFP；EGFP的zui大吸收峰位于488nm）。其他還包括發射熒光也發生改變的變體，包括藍色熒光蛋白：EBFP，EBFP2，Azurite，mKalama；青色熒光蛋白：ECFP，Cerulean，CyPet；黃色熒光蛋白：YFP，Citrine，Venus，YPet等等

小編發現綠色熒光蛋白中，單體性質比較好的是 mEmerald，該蛋白很少形成大的點狀結構，并且目前還沒有稱該蛋白會影響定位的報道。
此外 mEmerald 是一個非常穩定的綠色熒光蛋白，因此可以用于線性的結構光照明超分辨熒光顯微成像。

我們還發現紅色熒光蛋白中沒有一個單體性質特別好，相比較來說，mApple 的單體性質zui好，但是在使用該蛋白的過程中，發現 mAppple 會影響某些蛋白的定位，因此在使用紅色熒光蛋白時，要謹記紅色熒光蛋白可能會影響目標蛋白的定位。

PK 值每個熒光蛋白都有其zui合適的 pH 值，即在一定的 pH 值下，熒光強度zui高。有的熒光蛋白適合在酸性環境下使用，相反有的適合在堿性環境下使用，因此在選擇熒光蛋白時需要考慮熒光蛋白的 PK 值。
在細胞內，大多數細胞器內及細胞質的 pH 值都在 7.0 左右，然而溶酶體內的 pH 值就比較低，因此常規的熒光蛋白并不適合用于標記溶酶體內的蛋白。

mCherry 的 PK 值比較低，適合在酸性的環境下使用，可以用于標記溶酶體內的蛋白，但是該熒光蛋白有一定的二聚性質，可能會影響目標蛋白的定位，在使用該熒光蛋白時要綜合考慮單體性質和 PK 值。

在選擇熒光蛋白時，要考慮目標蛋白定位環境的 pH 值，再考慮使用相應 PK 值的熒光蛋白。同時也可以考慮利用熒光蛋白的 PK 值的特性，幫助我們解決問題。

成熟時間熒光蛋白在發光之前需要經歷轉錄、翻譯、折疊等步驟，其中折疊過程占據了大部分時間，我們將此過程稱之為成熟時間。在標記短壽命的目標蛋白時，如果熒光蛋白的成熟時間太長，可能會出現在目標蛋白開始降解時，熒光蛋白還沒有發光，導致無法追蹤及定位目標蛋白。因此在選擇熒光蛋白時，需要考慮其成熟時間。

小編在實驗時發現，mEmerald、Dendra2 的成熟時間比較快，在用 Lipo2000 轉染試劑盒轉染 U2OS 細胞時，轉染后四個小時就能夠用熒光顯微鏡觀察到了熒光信號，EGFP 沒有信號。但是在用 P450 方法檢測時，Dendra2 會形成很大的聚集，表明該熒光蛋白的單體性質不好，有可能影響目標蛋白的定位和功能，在使用該蛋白的過程中應該注意這個特性。

為了能夠更早地觀察某些短壽命熒光蛋白的生理特性和定位情況，科學家正在發展成熟時間更快的熒光蛋白，并且用于超分辨成像。

光穩定性熒光蛋白在發光的同時會被漂白，逐漸失去發光能力，因此要想獲得更多的信息，就需要熒光的光穩定性好。在普通的熒光成像中，對熒光蛋白的光穩定性要求并不是很高，比如激光共聚焦顯微鏡成像時，熒光信號的穩定性只需要能保證采集的完整的一張圖即可。

在超分辨熒光成像中，對熒光蛋白的光穩定性要求比較高。線性結構光照明顯微鏡要求熒光蛋白始終處于亮的狀態，需要通過結構光采集多幅圖進行重構；非線性結構光顯微鏡則要求熒光蛋白在黑亮之間進行多次切換，這就要求熒光蛋白能進行反復的光調控，并且依舊維持著高的亮度；與非線性結構光顯微鏡一樣，可逆飽和光線性熒光轉移顯微鏡也要求熒光蛋白能夠在黑亮之間進行反復的光調控。

優化密碼子大多數熒光蛋白是來自于海洋生物，因此密碼子偏好性與所要標記蛋白的物種有較大的差異，這種密碼子偏好性差異可能會導致熒光蛋白在哺乳動物細胞或組織中的表達量極低，以至于看不到熒光信號。

幸運的是大多數熒光蛋白的密碼子已經經過優化，適合在哺乳動物細胞中進行融合表達。但是當需要使用熒光蛋白在其他種屬細胞內表達時，應考慮一下密碼子偏好性。

小編在進行線蟲熒光成像時，就遇到過此類問題，沒有優化密碼子時，熒光蛋白的表達量比較弱，在熒光蛋白經過密碼密碼子優化，并且在 DNA 序列之間插入線蟲的內含子后，熒光蛋白的表達量得到了較大的提高。

在比較少見的物種進行熒光成像時，需要把密碼子優化這個特性考慮在內。

N 端或 C 端在選擇了相應的熒光蛋白后，我們需要確定把目標蛋白放在熒光蛋白的 N 端或是 C 端。N 端與 C 端的區別在于目的蛋白，有的目的蛋白對這個要求不高，但某些目的蛋白就要求在特定的位置進行融合表達。

熒光蛋白與目的蛋白融合表達可能會影響目的蛋白的折疊，這取決于目的蛋白折疊過程中，熒光蛋白所在的那一端有沒有參與蛋白質的折疊。

例如，如果目的蛋白的 C 端會被折疊入目的蛋白的內側，那么我們把熒光蛋白標記在目的蛋白的 C 端，將獲得不到熒光信號；有些目的蛋白在后翻譯的過程會切掉一段，如果熒光蛋白處于被切的一端，那么就不能獲得準確的目的蛋白的定位信息。

如果標記的目的蛋白是一個新的蛋白，我們建議分別進行 N 端和 C 端融合表達，以此來確定哪一個是zui好的選擇。除此之外，還可以用免疫熒光來確認目的蛋白定位是否與熒光蛋白融合表達的一致。

綜合以上的介紹，在我們選擇熒光蛋白時，首要考慮的是熒光蛋白的聚合性質，即是否會影響目的蛋白的功能及定位，其次是熒光蛋白的 PK 值是否與目的蛋白所處的環境的 pH 值相匹配，然后是熒光蛋白的成熟時間以及目的蛋白的壽命，綜合兩者決定熒光蛋白是否合適，zui后考慮熒光蛋白的光穩定性、密碼子偏好性是否合適，zui后考慮目的蛋白放的位置，熒光蛋白是否會影響目的蛋白的功能及定位。

此外，在進行熒光成像時，需要考慮顯微鏡所選的濾光片是否與相應的熒光蛋白質配套，顯微鏡的各種參數是否合適。值得提醒的是，激發光的強度不能太高，否則會導致熒光信號的漂白。