常見熒光蛋白介紹

常見熒光蛋白：

綠色熒光蛋白（green fluorescent protein,GFP）

在光譜的綠光區（500nm-525nm）已經發現了多種熒光蛋白，而且來源廣泛，包括不同種屬的Aequorea 、橈足類動物、文昌魚以及珊瑚。然而多數有齊聚反應，即使zui好的熒光蛋白與EGFP相比，也沒有明顯的優點?；蛟S目前活細胞成像zui好的選擇是GFP衍生的Emerald（祖母綠），它與EGFP的特性相似。Emerald包含F64L 和S65T突變，另外還有四個點突變從而改進了折疊、37℃時的突變率以及亮度。雖然Emerald比EGFP更有效，但含有快速光漂白成分，可能在某些環境下其定量成像會受到影響。

上圖為在LUYOR-3415RG照射下葉片GFP發出綠色熒光（圖片轉自http://www.luyoruv.com,版權歸屬上海路陽生物技術有限公司，）

下面主要介紹GFP及其衍生型熒光蛋白：
（1）綠色熒光蛋白的來源
綠色熒光蛋白zui早由美籍日裔科學家下村修于1962年在水母中發現。這種蛋白質在藍色波長范圍的光照激發下發出綠色熒光，其發光過程需要冷光蛋白質Aequorin的幫助，而且，這個冷光蛋白質可與鈣離子（Ca2+）相互作用。在水母中發現的野生型綠色熒光蛋白的分子量較小，僅為27~30kDa，而編碼GFP的基因序列也很短，為2.6kb。
（2）綠色熒光蛋白性質
GFP由238個氨基酸殘基組成。GFP序列中的65-67位殘基（Ser65-Tyr66-Gly67）可自發形成熒光發色基團——對羥基苯咪唑啉酮GFP的激發光譜在400nm附近有一個主激發峰，在470nm附近有一個次激發峰。發射光譜在505nm附近有一尖銳的主發射峰，在540nm附近有一肩峰GFP的化學性質相當穩定，無光漂白現象（Photobleaching），用甲醛固定和石蠟包埋亦不影響其熒光性質。在細胞生物學與分子生物學領域中，綠色熒光蛋白基因常被用作報告基因。
（3）野生型綠色熒光蛋白

野生型GFP（wild type GFP, wtGFP）從一開始就引起了人們極大的興趣，而且被用作新型的簡單報告基因及體內標記，但GFP在異源生物體中的表達并非那么簡單。例如，研究人員很早就發現需要在較高的溫度下孵育才能在細胞或生物體中表達GFP，并且wtGFP在37℃的熱穩定性差。這些都阻礙了它在轉基因中的應用。這些難題促使人們進一步篩選分離wtGFP的變體?，F在，人們已經找到了熒光強度更強且更耐熱的變體。這些變體多數為經突變的脫輔基蛋白，它們可防止高溫導致的錯誤折疊。近年來出現的新型wtGFP基因突變體的激發和發射譜發生了改變，熱穩定性和熒光強度得到了提高，GFP報告基因在小鼠中的應用就是以這些變體作為基礎的。
（4）增強型綠色熒光蛋白（EGFP）
現在，應用zui為廣泛的是紅移變體增強型GFP（EGFP）。諸如EGFP這些紅移變體的zui大激發峰發生紅向移動，大約為490nm，這一波長也恰好是多數分光設備、流式細胞儀及共聚焦顯微鏡的常用波長。EGFP有兩個氨基酸突變，當被藍光激發時，它發出的熒光要比wtGFP亮30-40倍。wtGFP和包括EGFP在內的多數變體半衰期長，所以不適合追蹤表達的減少或損耗。
（5）不穩定增強型綠色熒光蛋白（dEGFP）
為克服這一問題，人們在1998年構建了不穩定增強型綠色熒光蛋白（dEGFP）。原理就是將EGFP的cDNA融合到小鼠鳥氨酸脫羧酶（Ornithine decarboxylase, ODC）基因的C-末端。ODC含有一個PEST序列，這個序列可促進該蛋白在細胞內的降解。雖然，目前這些不穩定變體還沒有在小鼠中應用，但這些變體有利于實時追蹤基因表達動力學的研究。
（6）增強型黃色熒光蛋白（EYFP）
另一種紅移變體是增強型黃色熒光蛋白（EYFP），該變體有四個氨基酸突變。在527nm時，EYFP的發射光從綠色變為黃綠色。EYFP熒光的亮度水平與EGFP相當。EYFP 抗酸性差、對鹵化物敏感，使它的應用受到限制。在EYFP 基礎上改進的突變體mCitrine[21]和mVenus[22]是目前應用zui多的黃色熒光蛋白。
（7）增強型藍色熒光蛋白（EBFP）
在光譜的另一端是藍色/藍綠色變體，包括增強型藍色熒光蛋白（EBFP）變體。它有四個氨基酸突變，激發波長和發射波長分別為380nm和440nm。由于這些突變改進了蛋白折疊和發色團形成的效率，所以也增強了所發出熒光的亮度（與藍色變體相比）和蛋白溶解性。但的不足之處，就是EBFP產生的熒光信號
大致與wtGFP相當。藍色熒光蛋白發光較弱，抗光漂白和抗酸性較差，用于細胞成像時背景信號高。針對EBFP開發的3個更亮的突變體：Azurite (亮度是EBFP 的1.6 倍)、EBFP2(亮度是EBFP的2倍，mTagBFP(亮度是EBFP的3.7倍)。zui亮的藍色熒光蛋白。mTagBFP 是由紅色熒光蛋白TagRFP突變而來。
（8）增強型藍綠色（青色）熒光蛋白（ECFP）
增強型藍綠色熒光蛋白（ECFP）是發出藍色/藍綠色熒光的另一種變體，產生的熒光信號要比wtGFP強。ECFP有六個氨基酸突變（表3），發射光譜從綠色遷移到藍綠色，zui大激波長在433nm（主峰）和453nm（次峰），zui大發射在475nm，于510nm處有一肩峰（圖11）。ECFP另一特點是比其它藍色/藍綠色變體光漂白效應弱，而且比EBFP的亮度強。值得一提的是，wtGFP的主要綠色熒光變體，如EGFP等已經在ES細胞、基因打靶和轉基因小鼠研究中得到充分應用。

藍色及藍綠色熒光蛋白

雖然EBFP是Aequorea GFP來源的zui早的光譜變體之一，但其亮度低、光穩定性差，使其很久以來沒有引起多數研究者的注意。zui近，有三個研究小組報道指出，改進的藍色Aequorea 熒光蛋白變體與EBFP相比，亮度和光敏感性有明顯增強。這些新的變體被命名為Azurite（石青或藍銅礦）、強力增強型藍色熒光蛋白2（strongly enhanced blue fluorescent protein 2, SBFP2）及EBFP2，它們次使得活細胞在藍色光譜區域成功地長時間成像成為可能。即使這三種熒光蛋白在高濃度的微環境中表現出很弱的二聚體特性，但是它們能夠在與亞細胞定位的靶蛋白融合中有效地發揮作用，并且它們能夠很容易地通過濾光片設備與標準的BFP及4', 6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI）一起成像。這些BFP變體都可以通過A206K突變改造成真正的單體，而且這種突變不會影響它們的特性。更重要的是，亮度zui強、光穩定性zui強的藍色熒光蛋白EBFP2，是EGFP在活細胞中FRET的很好的供體。

黃色熒光蛋白

熒光蛋白的改造遵循這樣一個宗旨，那就是越紅越好.普遍認為，長波長光子的激發對細胞和組織的光毒性小，且自體熒光和動物組織的光吸收都是zui小。這些因素意味著紅色的熒光基團對比度提高（因為背景應該降低），且更適合于體內成像。于是，熒光蛋白的改造慢慢向紅色偏移。
黃色熒光蛋白zui早的變體EYFP（表6）雖然仍被廣泛應用，但由于其pK a值高、對鹵化物敏感，導致EYFP的應用還很不理想。單體形式的變體檸檬黃（mCitrine）和維納斯（mVenus）是目前應用zui多的黃色熒光蛋白探針，但二者都還沒有商業化。然而與之相似的，來源于Aequorea 被命名為誕生石Topaz（黃玉）的變體可從Invitrogen公司買到。
另一種很有應用潛力的黃色熒光蛋白是能量轉移黃色熒光蛋白（yellow fluorescent protein for energy transfer, YPet），它經合成的DNA重排獲得，與熒光激活的細胞分選術結合能夠增強FRET中藍綠色熒光蛋白和黃色熒光蛋白的配對。YPet是已經開發的亮度zui強的黃色熒光蛋白，并且有很好的光穩定性。YPet對酸性環境的耐受性要比mVenus及其它黃色熒光蛋白變體強。

橙色熒光蛋白

在橙色和紅色波長（約560nm到650nm）光譜區僅僅開發了幾種探針。盡管如此，現有的這幾種光譜型的蛋白都是從珊瑚中分離得到的，并且在多種成像情景中顯現出應用潛力，但在對橙色區域熒光蛋白的命名中存在混亂。通常被命名為紅色熒光蛋白RFP的探針如DsRed、TagRFP及tdTomato，實際上具有明顯的橙色多于紅色的發射譜。不考慮顏色的指示，用標準的四甲基羅丹明異硫氰酸脂（tetramethyl-rhodamine isothiocyanate, TRITC）濾光片設備，橙色光譜型的蛋白在多種顏色，如藍綠色、綠色和紅色情景中更易于成像。

紅色熒光蛋白

紅色熒光蛋白(drFP583 )是人們從珊瑚蟲Discosoma gen。中克隆的一種與綠色熒光蛋白(GFP)同源的熒光蛋白，在紫外光的照射下可發射紅色熒光，有著廣泛的應用前景;但它自身的缺點如寡聚化、成熟緩慢等限制了它的進一步應用。因此，人們對它進行了一系列修飾和改進，得到了寡聚化程度低(甚至單體)和成熟速率快的突變體，Clontech公司已將一種突變體商業化，命名為DsRed。與GFP 相比，DsRed的激發和發射波長較長，其發射峰位于培養基、組織培養器材及細胞成分等產生的熒光背景范圍之外，具有較高的信噪比;而且在細胞內熒光轉換效率高，更易檢測。較早報道的紅色熒光蛋白(DsRed) 的突變體有mBanana、mOrange、dTomato、mTangerine、mStrawberry 和mCherry。
在活細胞及動物全身成像中需要表現較好的紅色熒光蛋白，主要是由于在多種顏色成像實驗中需要紅色探針，另外基于較長的激發波長產生的光毒性較小，可以用來探測較深的生物組織。zui新研究進展是，通過mRFP1（表6）發色團殘基的直接突變產生的新的熒光蛋白，得到的單體熒光蛋白發射峰在560nm～610nm，并以相應的水果名字來命名。這其中mStrawberry和mCherry，發射峰分別為596nm和610nm（表6，圖22k），亮度分別為EGFP的75%和50%左右。mCherry的光穩定性要遠強于mStrawberry，所以長期成為成像實驗中mRFP1zui好的替代品。這些以水果命名的熒光蛋白單體與mKO和TagRFP共同填補了水母紅移熒光蛋白（如YPet）與大量低聚紅色珊瑚熒光蛋白間的空白，并且目前已經商業化。雖然，某些熒光蛋白缺乏許多成像實驗所需要的亮度和光穩定性，但是它們的存在提示我們，zui終可以找到跨越整個可見光譜的亮度高、穩定性強的單體探針。

熒光蛋白突變體