熒光顯微鏡的原理和操作步驟

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熒光顯微鏡的原理是什么?

與普通光學顯微鏡不同，熒光顯微鏡不是通過普通光源的照射來觀察標本，而是利用一定波長的光（通常是紫外光、藍紫光）在顯微鏡下激發標本中的熒光物質發出熒光，所以，熒光顯微鏡光源的作用不是直接照射，而是作為能量源激發標本內部的熒光物質。我們之所以能觀察到標本，是由于光源的照射，而是標本中的熒光物質吸收激發光能后呈現的熒光現象。

由此可見，熒光顯微鏡的主要特點是它的光源可以在特定波長范圍內提供大量的激發光，使被測樣品中的熒光物質能夠獲得被測物的激發光。必要的強度。同時，熒光顯微鏡必須有相應的濾光系統。

熒光顯微鏡是免疫熒光組織化學的重要工具。它由超高壓光源、濾光系統（包括激發和加壓濾板）、光學系統和照相系統等主要部件組成。它利用一定波長的光激發標本發射熒光。

激發熒光的方式：根據光的波長范圍分為UV激發法（使用紫外照射法）和BV激發法（使用藍紫光）。紫外激發法使用短于 400 nm 的近紫外光進行激發。該方法沒有可見的激發光，因此觀察到的熒光表現出染料的固有熒光，很容易區分標本上的特異性熒光和背景組織的自發熒光。

BV激發法是從紫外光激發到以404nm和434nm為中心的藍光。這種方法使用藍光照射標本，因此熒光觀察系統的截止濾光片必須使用能夠完全阻擋藍光并完全通過所需的綠色和黃色熒光的濾光片。用于熒光抗體測定的熒光染料。激發光的*大吸收波長與熒光的*大發射波長比較接近，所以BV激發法中使用的濾光片必須使用銳截止濾光片。該方法可以使用藍光作為激發光，因此熒光染料的吸收效率高，可以獲得更亮的圖像。缺點是500nm以下看不到熒光，500nm以上會使整個圖像呈現黃色。在熒光抗體法中，大部分熒光染料都是獨特的。因此，在討論細微特異性時，上述 BV 激發方法的缺點往往影響很大。

綜上所述，熒光顯微鏡的照明根據聚光鏡的結構和激發光的波長可以分為以下三點。

1.從熒光圖像的對比度要求來看，紫外激發的暗場聚光鏡*適合照明。

2.考慮到圖像的亮度，BV激發濾光片的暗場觀察效率*高。

3.UV激發濾光片暗場觀察和BV激發暗場聚光鏡照明的特點可以說是介于這兩種照明方式之間，但前者的濾光片暗場特性更強，顯示的圖像更亮，對比度??；后者保留了暗場光路的特性，因此顯示圖像更暗，對比度提高。實際使用熒光顯微鏡時，應使用*適合標本要求的照明方法進行觀察。

必須指出的是，即使是用對比度*好的紫外激發暗場聚光器照射時，被試樣折射或散射的部分紫外激發光也會進入物鏡，使加膠面和光學玻璃中的加膠面光學系統會受到激發的影響，產生的自發熒光會使圖像的響應變差。因此，必須在目鏡前使用吸收紫外線的濾光片作為截止濾光片。

 熒光顯微鏡的基本操作步驟

1.安裝紫外線防護罩。

2.打開高壓汞燈電源控制箱開關。本文來自檢驗條網

3.插入遮光罩以中斷光路。

4.預熱5-10分鐘。

5.將載有樣品的載玻片放在載物臺上。

6.選擇物鏡（按先低倍，后高倍的順序）。

7.轉動分光鏡組件轉盤，選擇需要的分光鏡組件：“O”為觀察透射光； “WU”用于觀察藍色熒光（如DAP1）； “WB”用于觀察綠色熒光（如FITC）； “WG”用于觀察紅色熒光（如TRITC）。

8.使用阻塞濾光片（目前大多數阻塞濾光片都內置在熒光顯微鏡中）。

9.通過粗細螺旋調節焦距。

10.打開連接顯微鏡的電腦，點擊數字成像系統軟件，采集數字圖像。

熒光顯微鏡的注意事項

1.由于熒光觀察所用的光源是高壓汞燈，發出的光中含有紫外線，對人眼有害，所以必須加裝紫外線防護罩。本文來自巡檢區網

2.為延長水銀燈的使用壽命，水銀燈打開后不能立即關閉，以免水銀蒸發不完全而損壞電極，一般需要15分鐘才能關閉。

3.水銀燈熄滅后，待完全冷卻后再重新啟動。否則，燈內的水銀蒸氣還沒有恢復到液態，內阻極小。如果再次施加電壓，會造成短路，導致汞燈爆炸。這不僅會損壞電器，更重要的是，汞蒸氣會溢出，從而導致工作室受到污染。因此，關閉水銀燈后，不能立即再次開啟，必須至少等待 30 分鐘。

4.高壓水銀燈工作時放出大量熱量。因此工作環境溫度不宜過高，必須有良好的散熱條件。

5.汞燈的使用壽命約為200-300小時。電源控制箱上有一個時間累積計數器。用戶需要記錄累計小時數，當達到300小時時，需要更換新燈泡，否則亮度不夠，影響觀察。

熒光顯微鏡標本制作特點及觀察要求

1.幻燈片：幻燈片的厚度應該是0.在 8mm 到 1.2mm 之間，載玻片太厚，無法吸收更多的光，激發光難以聚集在標本上。載玻片必須光滑、厚度均勻且沒有明顯的自發熒光。有時使用石英玻璃載玻片。

2.蓋板玻璃：蓋板玻璃的厚度應在0.17mm左右，光滑、干凈。為了增強激發光，也可以使用干涉蓋玻片。這種特殊的蓋板玻璃表面鍍有幾層物質（如氟化鎂），對不同波長的光有不同的干涉作用，可以使熒光順利通過和反射。激發光，這種反射的激發光激發樣品中的熒光。

3.標本：組織切片或其他標本不宜太厚，一般5-20pm。太厚的切片會導致大部分激發光在試樣下部被消耗，而物鏡直接觀察到的試樣上部不能被激發。切片折疊或雜質過多會影響熒光觀察。

4.封固劑：封固劑必須無自發熒光，五色透明。添加防淬火劑后，用指甲油（實際使用中，指甲油密封效果很好，可以薄而均勻）將蓋板玻璃密封在其周圍，這樣不僅可以防止蓋板玻璃滑動，還能防止抗衰老。猝滅劑蒸發。在沒有抗淬滅劑的情況下，也可以使用含30%甘油的PBS，或等量的甘油和0.5mol/L碳酸鹽緩沖液（pH 9.0-9.5）的混合物封片。

5.鏡片的清潔：油性鏡片使用后，需要用無水乙醇或3：7酒精醚混合物擦拭鏡片紙。

6.及時觀察：染色后的標本要及時觀察，因為時間長了熒光會逐漸減弱。如果將標本存放在 4°C 的聚乙烯塑料袋中，可以延遲熒光衰減時間。